编 者 按 近日，清华大学精密仪器系尤政教授团队提出了基于点阵激光激发方法的高通量流成像方法。该方法可实现低成本、高可扩展性的成像流细胞仪，并首次验证了全光谱成像流技术。相关结果以“相关结果”为基础Imaging flow cytometry using linear array spot excitation以期刊为题《Device》上发表，并被选为当期封面文章。 研究背景和成果 流式和显微镜是细胞检测的两种基本工具。流动技术具有高通量和丰富的分子检测信息，但缺乏细胞形态信息；相反，荧光显微镜可以提供细胞图像信息，但检测通量低，难以获得足够的样本数据进行统计分析。自流细胞仪出现以来，其发展趋势一直是在保持高检测通量的同时增加更多的信息维度，如空间形态信息或光谱信息，以实现更准确的细胞分析或分选。成像流式技术是一种集流式细胞仪高检测通量和荧光显微镜空间分辨率于一体的仪器。然而，由于成像通量、分辨率和检测灵敏度之间的基本矛盾，现有的成像流技术通常采用复杂的光路系统和复杂的图像重构算法，成像的可扩展性也非常有限。这使得成像流式细胞仪难以达到传统流式细胞仪等高检测通道数，其高技术成本限制了应用范围。 为了解决这些问题，清华大学精仪系尤政教授课题组提出了一种基于点阵激光刺激的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。该方法的核心思想是用点阵结构光斑代替传统流式细胞仪中的椭圆或条状光斑，从而赋予流式细胞仪成像能力。 图1：点阵激光激发成像原理 图1显示了成像方法的工作原理。在检测区域，激发光斑是由衍射光学器件产生的一串等间隔点阵光斑，其间隔大于细胞大小，其排列线和细胞运动线呈一定的小角度。当细胞依次通过照明光斑时，会产生一串荧光和散射光信号。在图像重构阶段，细胞图像只能通过信号的分割和重组来重建。该方法具有实现简单实时重建的优点，与现有流细胞仪光路结构兼容，具有良好的可扩展性，在高检测通量的基础上实现多激光、多荧光通道和无标记成像。 展示技术成果 图2. 双激光五通道成像流系统 图3.细胞器对成像和细胞周期进行研究 本研究以LASE成像方法为基础，构建了一个成像系统，具有2色激光(488nm/638nm)和5个成像通道(明场、FITC、PE、PI、APC），如图2A所示。该系统经验证为30×30μ在m的成像视场下，有1.3μ空间分辨率为m。当细胞样本以5m/s的流速通过探测区域时，系统可以进行无标记的明场成像和荧光成像，无运动模糊，成像通量可达每秒5000个细胞。该系统不仅可以成像细胞中的细胞器结构（见图3A），还可以在多个荧光波段下成像不同的细胞结构（见图3B）。在生物学应用中，图像被广泛视为金标准，因为它可以为细胞分析提供更丰富、更准确的信息，从而更详细、更准确地进行细胞分类。例如，在传统流式的基础上，可以进一步区分细胞周期M的细胞核形态，如图3C所示。 图4. 32通道全光谱成像流验证 由于LASE成像方法的高可扩展性，本文在棱镜色散的32通道光谱仪中引入了成像荧光信号，初步验证了全光谱成像流细胞仪的可行性。该系统可以同时在32个光谱通道上成像细胞，同时保持每秒5000个细胞的检测速度通量。借助光谱分解算法，可以有效解决多染料检测实验中染料光谱混合效应的问题，将成像流细胞仪的理论可检测染料数量扩展到30以上。这将大大提高成像流细胞仪对单细胞分析的信息量。 成果优势 点阵激光激发的成像方法具有以下优点：