生物分子的实时检测对于体外诊断、疾病早期检测以及日常健康监测和管理至关重要。类固醇性激素如孕酮（P4）、雌二醇（E2）和睾酮等，虽然在体内浓度极低（< nM），但是在调节生长发育和孕产中至关重要。在临床实践中，一般采用过程繁琐且有创的血液样本检测来评估体内激素水平，需要专业人员与复杂的仪器设备。使用唾液进行无创检测一直是更受青睐的方案。然而，唾液中的游离激素仅占血液中总激素水平的1% ~ 2%，阻碍了唾液性激素检测的实际临床应用。此外，由于各种体液内激素含量存在差异且在不同时期有几个数量级的波动，对于极低检测限、宽浓度范围且操作简易的性激素检测及动态监测存在着巨大需求空间。
近期，中山大学材料科学与工程学院谢庄副教授课题组提出了一种三维微结构柔性高分子电极策略，实现了低成本亚飞摩尔级的性激素电化学免疫传感。该传感器能够直接检测高度稀释的唾液样本中的激素，无需使用离心等仪器，从而便于在家中进行唾液检测和监测整个女性月经周期中的唾液P4和E2。传感器的核心是基于在微金字塔阵列涂覆掺杂三氟甲烷磺酰胺锂（LiTFSI）的聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）：聚（4-苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）的导电高分子电极及用于促进激素抗体固定结合的金纳米粒子（AuNPs）。这种简单的免疫传感工作电极通过微针尖促进分子扩散富集，可以在几分钟内经由微分脉冲伏安法（DPV）的峰值电流下降，实现P4和E2在亚飞摩尔到微摩尔水平的高灵敏宽范围电化学检测。
图1 以PEDOT:PSS涂层的柔性微金字塔阵列作为工作电极，通过电化学免疫传感法居家监测唾液内孕酮（P4）和β-雌二醇（E2）的示意图。该柔性可穿戴设备可利用微分脉冲伏安法（DPV）获得对甾体类激素的灵敏识别。
图2 （A）涂覆PEDOT:PSS/LiTFSI的微金字塔阵列的SEM图；（B）在过电位下，电解质中的Fe(CN)₆⁴⁻在微金字塔电极阵列周围扩散的剖面有限元模拟结果；（C）单个微金字塔电极的三维局部电流密度分布以及随着尺寸变化的电流和面积的增强比；（D-E）微金字塔阵列与平面PEDOT:PSS/LiTFSI电极的循环伏安法（CV）和DPV电流信号对比。
图3 （A）免疫传感电极的制备示意图；（B）电沉积AuNPs（左）和孵育P4抗体（右）后的微金字塔PEDOT:PSS电极的SEM图像；（C）电极修饰过程对应的DPV变化图；（D）检测P4的DPV典型结果，检测范围从1 fM到1 μM。（E）微金字塔、微针尖和平面结构电极的DPV峰值电流变化（ΔI）随P4浓度变化的标准曲线图；（F）修饰E2抗体的免疫传感器检测E2的DPV曲线和标准曲线图；（G）唾液中正常浓度的常见干扰物在免疫传感电极上的归一化DPV电流响应，表明免疫传感电极具有良好的选择性。
图4 （A）微金字塔电极在10,000次重复弯曲循环后的CV峰值电流仍基本保持不变，弯曲曲率半径为2 mm。插图显示了弯曲循环期间的典型CV曲线。（B）柔性免疫传感电极在不同弯曲条件下检测P4的标准曲线。所有比例尺均1 cm。（C）将免疫传感电极搭载到手套上进行P4测试，结果表明手指弯曲对测量几乎没有干扰。相应的DPV峰值电流变化可以忽略不计。（D）在4°C下保存14天期间，器件仍能检测1 fM P4。
图5 （A）免离心居家检测唾液性激素的方案示意图，可用于女性健康监测。（B-D）离心处理后男性唾液样本的唾液测试结果，包括在100倍稀释唾液样本中掺入各种浓度P4的DPV检测曲线，以及100倍和1000倍稀释样本的校准曲线及检测准确度。（E）通过无离心测试，在10 ~ 1000倍稀释的男性唾液样本中使用一系列加标P4溶液的典型电流响应图，分别标定出样本本底P4。插图显示了测试1000倍稀释样品时的相应DPV曲线。（F）1000倍稀释的男性唾液中加标E2的校准曲线图。（G）通过无离心唾液测试，在4周内对1000倍稀释女性唾液样本中的P4和E2浓度水平进行监测。不同的激素水平可表明月经周期的不同阶段，特别是可以预测中间短暂的排卵期。
综上所述，这项工作基于PEDOT:PSS/AuNPs的3D微金字塔电极的柔性电化学免疫传感器实现了甾体类激素的亚飞摩尔级水平检测。通过利用3D微结构电极的传质增强原理，使检出限降低1000倍，同时保持了宽的线性范围（亚fM ~ μM）。如此低的检测限十分适用于检测高度稀释后的人类唾液样本中的超低浓度甾体类性激素，同时以非侵入性和免离心的方式实现居家监测女性激素水平。所提出的用于提高检出限和检测范围的3D微金字塔状聚合物电极可以作为一种通用的生物传感方法进行进一步探索。从精确的临床诊断和咨询、生物活性物种的体内检测到食品和环境中有害物质的追踪，这种超灵敏和柔软的三维微结构电极平台将为广泛的应用奠定基础。
该成果日前以“Tip-Enhanced Sub-Femtomolar Steroid Immunosensing via Micropyramidal Flexible Conducting Polymer Electrodes for At-Home Monitoring of Salivary Sex Hormones”为题发表在ACS Nano期刊上。中山大学材料科学与工程学院硕士生李钊贤为第一作者，材料科学与工程学院谢庄副教授、中山大学附属第一医院生殖医学中心张丽梅博士为共同通讯作者。该研究受到国家自然科学基金（22075325）、广州市科技局（202002030434，2023A04J2177）与中山大学培育重点项目（23ptpy51）资助。