【仪表网 研发快讯】结构光照明显微镜(SIM)以成像速度快、无需特殊荧光标记和光毒性小等优势，被视为当前最适合活细胞成像的超分辨(SR)技术。经过二十多年的快速发展，SIM在成像理论和应用研究方面都取得了长足进步，但依然有许多普遍存在的棘手问题亟待解决和完善。
中国科学院苏州生物医学工程技术研究所李辉团队着眼于解决SIM在实际生物成像应用中的短板，致力于打造“user acknowledgeable”的SIM成像技术和仪器装备，最近在避免结构光参数估计、深度学习图像重构、升级宽场显微镜系统的模块化SIM解决方案等方面取得系列重要进展。
长期以来，大多数SIM算法直接或间接遵循标准的Wiener-SIM架构或依赖于其重建结果。Wiener-SIM重建涉及耗时的照明条纹参数估计和伪影敏感的频域去卷积。此前，李辉团队发展了基于“频谱优化”理念的高保真SIM重建技术HiFi-SIM并发表于Light: Science & Applications, 10, 70, (2021)，有效克服了SIM图像中的典型伪影，但HiFi-SIM仍依赖于结构光条纹参数的精确估计。然而，条纹参数很小的偏差就会导致Wiener-based SIM算法产生明显伪影，实践中现有的参数估计方法在很多成像场景中经常难以估计出可靠的条纹参数。更关键地，Wiener-SIM重建假设条纹参数在成像视场内均匀分布，但采集图像的条纹参数不仅依赖于条纹质量还受样本特性影响，因此难以保证全视场中的均一性。
针对上述问题，李辉团队的文刚等开发了一种无需估计结构光条纹参数的直接重建SIM算法，direct-SIM (direct reconstruction SIM algorithm)。该方法采用空域直接重建与频域频谱优化相结合的联合重建策略，避免了耗时且麻烦的条纹参数估计，同时采用新型频谱优化策略绕过了伪影敏感的频域Wiener滤波去卷积(图1a)。得益于其局域独立重建的特性，direct-SIM对于包含多组不同条纹的场景依然能够重建高质量SR图像(图1b)。该研究成果以“Spectrum-optimized direct image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy”为题发表于PhotoniX 期刊(中科院1区Top，IF16.5)，其中，文刚副研究员为第一作者，唐玉国研究员和李辉研究员为通信作者。
相比于上述基于物理模型的SIM算法，深度学习近年来被广泛用于SIM超分辨图像重建来减少样本光漂白和光毒性。然而，数据驱动的深度学习算法用于预测未经训练的生物结构的可靠性仍饱受质疑。当前，基于深度学习的SIM算法需要对不同生物样本单独训练以达到理想的预测性能，但仍难以可靠地应用于未训练结构的观察。
为此，李辉团队进一步发展了一种基于关键帧辅助的动态SIM成像方程，命名为KFA-RET：在动态成像过程中，第1帧SR图像由成像初始采集的完整原始图像通过传统SIM重建算法重建，该高保真SR图像被作为关键帧参与后续重建；随后通过基于深度学习的重构算法KFA-RET实现宽场图像的SR重建。KFA-RET以关键帧结构作为参照并结合生物结构的时间连续性，极大地提高了重建SR图像的质量，同时有效地减少了光漂白和光毒性。此外，KFA-RET对网络未训练过的新生物样本结构也具有很强的迁移能力。该研究成果以“Keyframe-aided resolution enhancement network for dynamic super-resolution structured illumination microscopy”为题发表于Optics Letters，其中博士研究生唐于珺为论文第一作者，李辉研究员为通信作者。
为了适应更多不同用户对SIM成像仪器配置的要求，李辉团队在之前开发安装于显微侧边的结构光照明插件(HiFi-SIM-C)的基础上，进一步开发了安装于显微镜后口的结构光照明模块HiFi-SIM-B。可安装于多款国产和进口的倒置荧光显微镜，并且与常规的宽场荧光照明器兼容，具有体积小、稳定性高、安装方便等优点，为实验室原有荧光显微镜进行高性价比的超分辨升级改造提供了更多选择。目前，搭载在国产舜宇IRX60倒置荧光显微镜的HiFi-SIM-B样机在2023年细胞生物学大会展，获得广泛关注。搭载在奥林帕斯IX73手动倒置荧光显微镜的HiFi-SIM-B样机也于近期交付中国科学技术大学生命科学院使用。
图3 (a)兼容荧光照明器的显微镜后口结构光照明模块HiFi-SIM-B; (b)搭载在国产舜宇显微镜的HiFi-SIM-B在2023年中国细胞生物学第十八次学术大会(苏州)上展出; (c)搭载在奥林巴斯IX73显微镜上的HiFi-SIM-B在中国科学技术大学装机现场及成像效果图。